園藝植物中的抗性基因及其應用
20 世紀80年代以來植物基因工程技術發展迅猛,這就為植物抗性育種研究開闢了新的途徑,並形成了以園藝植物抗性基因研究為重點的對相關基因的定位、克隆、序列分析,抗性相關蛋白結構分類及外源基因的整合與表達等一系列新的研究熱點.
1.植物的抗性基因
植物抗性基因可分為兩大類: 第一類是功能基因, 這些基因編碼的蛋白質對逆境中的植物直接起保護作用; 第二類是調節基因, 它們編碼的蛋白質是在訊號傳導途徑和對逆境基因表達起調節作用中起調控作用的因子[1].
1.1功能基因
功能基因主要包括滲透調節基因、清除活性氧的酶基因及保護生物大分子的活性基因等.像海藻糖合成基因、脯氨酸合成基因、甘露醇合成基因、甜菜鹼合成酶基因、果聚糖合成基因、肌醇甲酯合成基因、多胺合成基因,這些都是與滲透調節有關的基因,如Cape ll等發現的Adc在水稻中的超量表達就緩解了乾旱條件下轉基因水稻葉綠素的損失, 並提高了抗旱性;而清除活性氧的酶基因能提高畫質除氧自由基的能力, 保護和穩定蛋白複合體及膜結構,也可以提高植物抗性,Gupta等發現過量表達Cu /Zn- SOD的轉基因菸草在冷和高光脅迫下過氧化物毒害耐性提高[1] ;調滲蛋白(OSM )相關基因、脫水蛋白基因、水通道蛋白( aquapormi , AQP)基因、蘋果酸酶、晚期胚胎發生豐富蛋白( LEA)等基因均在保護生物大分子及膜結構中起至關重要的作用,LEA蛋白具有抗旱保護作用、離子結合特性以及抗氧化活性;水孔蛋白存在於細胞膜和液泡膜上,在細胞乃至整個植物體水分吸收和運輸過程中發揮重要作用[4]. 有研究證明, 在乾旱誘導型啟動子驅動下, 水稻LEA3蛋白基因OsLEA3 - 1 顯著提高了抗旱性.
1.2調節基因
與抗旱相關的轉錄因子有DREB、MYC/MYB、bZIP、WRKY和NAC類，與抗病相關的35S 啟動子驅動的幾丁質酶chi5B 基因等,與抗重金屬有關的水孔蛋白基因TcPIP等.由於轉錄因子能在轉錄水平上調控一系列基因的表達, 所以轉化調節基因可能可以有效地提高植物的抗逆性.
OsSKIPa SKIP( Ski- in terac ting prote in)能積極調整細胞生存能力和水稻的抗逆性.轉基因水稻中OsSKIPa 的表達極大地提高了在逆境(脫落酸、鹽以及甘露醇)中的生長能力以及苗期和生殖生長階段的抗旱能力, 增加清除活性氧的能力和提高幹旱脅迫下與逆境相關基因的轉錄水平; DREB轉錄因子與抗逆基因啟動子區域中的DRE 順式作用元件(如擬南芥的rd10 、rd17 以及rd29A等結合, 參與乾旱、高鹽等脅迫應答反應, 增強植物的抗逆性[2] ;幾丁質酶chi5B 基因轉入菸草、油菜、水稻,在植物體內均能高效表達, 抗病性明顯[3] ;重金屬抑制根系對水分的吸收和運輸,在重金屬富集植物遏藍菜中克隆了2個水孔蛋白基因TcPIP,在重金屬脅迫下可能具有增強水分運輸的作用[4].
2.植物細胞的基因轉移
2.1農桿菌介導的基因轉移
植物傷口釋放出如乙醯丁香酮（AS）以及羥基乙醯丁香酮（OHAS）等的`訊號分子;VirA以及VirG基因在酚類物質的誘導下得到表達;VirD1和VirD2蛋白表達與T－DNA邊界重複序列結合解纏繞與切割,VirC1和VirC2參與下,形成T－DNA轉移中間體,並以DNA－蛋白質複合體形式存在和轉移,VirE1和VirE2參與該過程;T－鏈蛋白複合體（T－鏈、VirD2、VirE2）在VirB基因表達產物作用下,穿越細胞膜,VirB操縱子具有11個基因,產物定位於細胞膜上並形成一種膜結合T－複合體運輸器,其中VirD2和VirE2蛋白分別具有導航和核定位作用;VirD2、VirE2以及VirF蛋白進入植物細胞;T－鏈蛋白複合體轉移到細胞後,透過核膜上的小孔進入細胞核,與核DNA整合.
2.2病毒載體介導的基因轉移
隨著植物病毒分子生物學及遺傳學研究的不斷深入,用病毒基因組作為載體轉化植物細胞日益真到我們的重視,因為病毒載體能將外源基因匯入植物的所有組織和細胞中,而且不受單子葉或雙子葉的限制,有轉染植物細胞原生質體和轉染植物組織兩種形式.
轉染植物原生質體是以雙鏈DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因組作為載體,去除有關的致病性基因,換上外源基因,體外包裝成有有感染力的病毒顆粒,轉染植物細胞原生質體,並由此再生成整株植物.
轉染植物組織是以植物雙生病毒為載體的,植物雙生病毒式一單鏈DNA病毒,成熟的雙生病毒呈雙顆粒狀,每一個顆粒中含有一條不同的DNA單鏈.其中A鏈能單獨在植物細胞中複製,並含有一部分病毒包衣蛋白基因;B鏈編碼另一部分包衣蛋白基因及感染性基因.A、B兩條鏈必須同處於一個植物細胞中,方能形成有感染力的病毒.雙生病毒具有廣泛的宿主細胞範圍,因此是一種很有潛力的植物病毒載體.雙生病毒家族成員番茄金花葉病毒（TGMV）在轉染植物組織是的克隆表達載體的構建程式
3.植物抗性基因的應用
3.1草坪草的改良
草坪草的改良一直依賴於傳統的育種手段,雖然許多性狀已得到長足的改進,但改良的侷限性也已日益明顯. 將轉基因技術融合到傳統的育種手段中,可以兼顧抗性和草坪草品質兩方面, 定向改變草坪草的一些性狀,不僅可拓展改良的範圍,而且也有助於解決一些常規育種方法難以解決的特殊問題,創造新的草坪草品種. 1988年獲得首例轉基因草鴨茅, 1992年獲得第1個葦狀羊茅轉基因植株,接著轉基因技術在主要的草坪草品種上相繼獲得成功,如匍匐翦股穎(Agrostis palustris) 、草甸羊茅( Fes2tuca pra tensis) 、紫羊茅( Festuca rubra)等. 近年來,基因槍和農桿菌轉化技術日趨成熟,轉化的目標已轉向抗病蟲、抗寒旱、抗鹽以及提高草坪的色澤方面,在防止基因漂移方面也進行了初步的嘗試,但目前轉化的目標基因僅是單基因,尚未見到將含有耐旱寒、抗病蟲、抗除草劑等2 個基因同時轉化的報道,四季常綠的品種也未見報道. 目前,轉基因草坪草尚未進入商業化應用階段[4].
3.2提高蔬菜產量
培育抗逆境雜交新品種是解決逆境脅迫，提高產量的關鍵所在.往往一些野生種蔬菜在適應周圍環境的過程中,逐步演化出一定的抗逆境性, 成為蔬菜抗逆境遺傳改良的寶貴資源.Eshed等就利用S. pennellii LA716 構建了單片段漸滲系, 利用該套漸滲系已對1 000 多
個控制不同型別農藝性狀的QT L 進行了定位, 廣泛應用於番茄產量、品質、抗病等遺傳改 良[5].
在後續植物抗性的研究中,我們應該考慮到:① 選用安全性較高的篩選標記基因;② 鹽、乾旱這幾種脅迫耐受的機制是相互干擾的;③ 植物受到脅迫和從脅迫中恢復的週期是一個普遍的過程,也是與脅迫耐受密切相關的;④ 應觀察長期脅迫對植物生長的影響,因為這種長期脅迫才更接近大多數作物的壽命.
轉基因植物抗性基因資源還有待進一步發掘,但隨著分子生物學技術和方法的不斷髮展和完善,植物抗性研究的不斷深入,在植物體內建立可受逆境脅迫誘導表達的、比較完善的抗逆境體系,將會有更多的抗境轉基因作物應用於生產實踐,造福於全人類.
參考文獻:
1.李曉慧,董明偉,劉康,等.植物抗旱基因及其功能研究進展[J]. 江蘇農業科
學,2009,5:73-76.
2.化燁,才華,柏錫,等.植耐鹽基因工程研究進展[J].華北農業大學學
報,2010,41(10):150-156.
3.謝曉亮,趙和,溫春秀,等. 抗病基因質粒pAHCGG的構建及應用研究[J].華北農
學報, 2003 , 18: 59- 62.
4.張玉秀,徐進,王校,等. 植物抗旱和耐重金屬基因工程研究進展[J].農業生態學
報,2007,18 (7) : 1631- 1639.
5.侯喜林,餘慶輝,王柏柯,等.番茄芽期耐鹽QTL 定位及其效應的初步分析[J].
西北植物學報, 2010, 30( 9) : 1792- 1798.