基因工程在林木抗寒中的應用研究論文
摘要：文章綜述了基因工程在林木抗寒方面的研究進展， 包括結構基因、順式作用元件、轉錄因子和轉基因技術。
關鍵詞：基因工程； 林木； 抗寒；
逆境會傷害植物， 嚴重時會導致死亡。當溫度下降到0℃以下時， 植物體內發生冰凍， 因而受傷甚至死亡， 這種現象稱為凍害。樹木在生長期中如遇到溫度的突然變化， 會打亂植物生理程序的程式而造成傷害， 迄今為止， 尚沒有解決低溫凍害的根本辦法。隨著基因工程的發展， 在樹木的抗寒性研究方面取得了進展。本文就結構基因、順式作用元件、轉錄因子和轉基因技術在林木抗寒中的應用與研究進展進行了闡述， 以期為林木抗寒相關研究提供參考。
1 結構基因
結構基因是一類編碼蛋白質的基因， 大多數真核生物的基因是不連續基因。所謂不連續基因就是指基因的編碼序列在DNA分子上是不連續的， 被非編碼序列所隔開。編碼的序列稱為外顯子， 是一個基因表達為多肽鏈的部分；非編碼序列稱為內含子， 又稱插入序列。內含子只轉錄， 在前mRNA時被剪下掉。一些抗寒相關的結構基因， 透過轉錄形成RNA， 再透過翻譯形成相關的蛋白質， 進而表現出抗寒的特性。2003年， 李春霞從胡蘿蔔中克隆得到抗凍蛋白基因， 並轉入山楊， 得到轉基因植株後經PCR檢測獲得1株卡那黴素的轉基因株系， 結果表明目的基因AFP基因已被整合進山楊基因組中[1]。2007年， Benedict等將擬南芥抗寒相關基因CBF1基因轉化到楊樹基因組中， 並證明該基因的成功表達可提高楊樹的抗寒性。
2 順式作用元件
順式作用元件， 位於結構基因的旁側， 包括啟動子、增強子、應答元件。它是轉錄因子的結合位點， 並透過這種結合進而調控下游基因轉錄， 確保轉錄的精確起始和轉錄效率。目前此方面在林木中研究較少， 相對滯後。此外， Li等[2]研究表明不同基因啟動子對抗逆基因的表達作用不同， 其中cor15基因啟動子要弱於cor15b基因啟動子對抗逆基因表達活性的影響， 此外還發現這種影響不僅與順式作用元件種類有關， 也與其數量密切相關。Khurana等[3]發現CCAAT—box和HSEs作為小分子熱激蛋白sHSP26啟動子中重要的熱激元件在表達調控中起了決定性的作用。
3 轉錄因子
轉錄因子即能夠結合在基因上游的特異核苷酸序列上的蛋白質， 並能調控該基因的轉錄。轉錄因子可以調控核糖核酸聚合酶 （RNA聚合酶， 或叫RNA合成酶） 與DNA模板的結合。同時在與該基因上游的啟動子區域結合的同時， 轉錄因子還可以與其他一些轉錄因子形成轉錄因子複合體， 進一步影響基因的轉錄， 進而影響蛋白質的合成。2014年， 羅夢雪等[4]從麻瘋樹基因組中克隆到一個CBF2基因 （命名為JcCBDF2） 。運用生物資訊學的分析手段對該基因序列及其編碼的蛋白質序列進行了分析， 結果表明， JcCBDF2蛋白中不止包含AP2/EREBP保守的結合結構域， 還具有CBF轉錄因子特徵序列。實時熒光定量結果顯示基因主要在麻瘋樹葉片內轉錄表達， 對低溫脅迫極其敏感， 初步研究表明基因是低溫誘導型轉錄因子。趙天田， 王貴禧， 梁麗松等[5]根據平榛花芽轉錄本高通量測序的結果， 採用RACE—PCR技術克隆到平榛S4OQ基因， 並對基因進行實時熒光定量表達分析， 表明：平榛雌花芽中的表達量最高， 隨後表達量逐漸下降， 在不同器官中的表達具有差異性， 雄花序中表達量最高。楊杞， 白肖飛， 高陽等[6]以沙冬青為試驗材料， 利用RT—PCR和RACE技術克隆了沙冬青CBF/DREB1基因cDNA序列， 並對其進行了序列分析， 運用生物資訊學預測其編碼的氨基酸序列具有CBF家族基因特有的AP2結構域。為進一步研究植物抗逆和獲得抗性基因提供了新的候選基因。
4 其他
4。1 小G蛋白基因
小G蛋白分子量約為20—30KD具有GTP酶活性， 在多種細胞反應中起開關作用。當小G蛋白與GTP結合時成為活化形式， 作用於下游分子並將其活化。當GTP水解成為GDP時， 小G蛋白恢復為非活化狀態。黃亞成等[7]從橡膠樹膠乳cDNA文庫中克隆1個小G蛋白的基因全長， 進行了聚類和表達分析， 採用實時熒光定量的方法研究該基因低溫處理下的表達水平。結果顯示4℃低溫脅迫下該基因在橡膠樹幼苗根中的表達明顯受誘導且在脅迫初期表達最強， 後又有所下降， 為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。
4。2 microRNA
microRNA （或miRNA） 是指參與轉錄後基因的表達調控， 由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子， 長度約為22個核苷酸。目前， 關於MicroR—NA的調控機理還不太清楚。2012年， 張譯雲[8]以毛白楊為材料， 進行不同時間段 （0、8、14、20h） 的低溫脅迫 （4℃） 處理， 分別提取小片段RNAs （<200nt） ， 利用實時定量PCR技術研究毛白楊在低溫脅迫後12種miRNAs的.差異表達規律。結果顯示， miRNAs的表達在低溫脅迫下有顯著變化， 且呈現動態反應。在低溫脅迫下， 大部分miRNAs的表達受到抑制。miR168a、miR169ac、miR394a—3p、miR530a的表達量在各個時間段顯著下調。表明， miRNAs在調控毛白楊對低溫脅迫的反應中起著重要作用。2012年， 張譯雲以毛白楊為試材， 透過構建microRNA的cDNA文庫， 經高通量測序獲得144個保守microRNA和29個新microRNA， 並用生物資訊學方法預測了新microRNA的101個靶基因， 且這些靶基因均與植物生長或逆境脅迫密切相關。該研究對進一步探討microRNA在毛白楊經低溫脅迫後的調控機制具有重要意義。
5 林木抗寒展望
目前， 抗寒性研究是林業抗逆性研究中重要一項， 並已深化到基因水平。雖然轉基因技術存在一定的爭議而且植物抗寒性狀作為質量性狀多受多基因控制， 抗寒分子機制相對複雜， 目前對這方面的研究仍不夠透徹， 經基因轉化獲得的抗寒性植株還有很大的盲目性。但利用轉基因技術增加林木抗寒性， 並不涉及食品安全問題， 同時一些寒冷脅迫應答基因已陸續被鑑定， 很多關鍵基因已透過轉基因技術成功提高了林木的抗寒性。近年來， 在大資料時代的潮流中， 基因晶片、轉錄組等高通量生物技術的成功應用進一步加快了抗寒相關候選基因的鑑定， 因此運用基因工程技術改善植物抗寒性將擁有越來越好的前景。
參考文獻
[1]馮連榮， 宋立志， 林曉峰。楊樹抗寒育種研究進展[J]。防護林科技， 2010 （1） ：92—94
[2]Li F， Han YY， Feng Y， et al。Expression of wheat expansin driven by the RD29promoter in tobacco confers water—stress tolerance without impacting growth and development[J]。Biotechnol， 2013， 163 （3） ：281—291
[3]Khurana N， Chauhan H， Khurana P。Wheat chloroplast targeted sHSP26promoter confers heat and abiotic stress inducible expression in transgenic Arabidopsis plants[J]。PLOS One， 2013， 8 （1） ：e54418
[4]羅夢雪， 高繼海， 時小東， 等。麻瘋樹耐冷基因JcCBF2的克隆及表達模式分析[J]。四川大學學報， 2014， 51 （6）
[5]趙天田， 王貴禧， 梁麗松， 等。平榛ChWRKY2轉錄因子的克隆及在低溫脅迫下的表達分析[J]。林業科學研究， 2012， 25 （2） ：144—149
[6]楊杞， 白肖飛， 高陽， 等。沙冬青CBF/DREB1轉錄因子的cDNA克隆及序列分析[J]。基因組學與應用生物學， 2009， 28 （6） ：1043—1048
[7]黃亞成， 秦雲霞， 劉林婭， 等。橡膠樹HbRAN1基因的克隆與表達[J]。熱帶作物學報， 2013， 34 （7） ：1257—1263