有關工程化的神經幹細胞的研究進展論文
1992年Reynolds等[1]首次從成年鼠的紋狀體和海馬中分離出能夠自我更新的多潛能細胞群落，首此提出神經幹細胞(Neural stem cells，NSCs)的概念。由於神經幹細胞具備自我更新能力和多分化潛能的生物學特性，為中樞神經系統疾病的治癒帶來了新的希望。隨著神經幹細胞分離培養技術的日漸成熟，並伴隨著基因工程技術飛速發展，研究者們可根據不同的科研目的，對神經幹細胞進行不同的基因工程改造，工程化的神經幹細胞隨之孕育而生。
1 工程化神經幹細胞的構建
工程化神經幹細胞移植治療技術是目前治療中樞神經系統疾病最具前景的治療方法之一。研究者們透過基因工程技術，將不同的目的基因片段成功構建於脂質體或病毒載體上，之後再將其成功匯入神經幹細胞，這種受基因調控神經幹細胞比其他普通幹細胞在治療中樞神經系統疾病上具有優勢。目前神經幹細胞工程化的研究主要表現在以下幾個方面：(1)神經幹細胞作為治療基因的載體，在其中插入不同目的基因的基礎片段，使神經幹細胞的功能性細化，與轉入的目的基因產生協同效果，達到更有效的治療效果;(2)可示蹤的神經幹細胞，透過基因工程將某些可示蹤的報告基因成功匯入神經幹細胞中，標記將要進行移植的神經幹細胞，使移植後的神經幹細胞在體內增殖、分化等過程更為有利地、直觀地觀察和研究;(3)永生化的神經幹細胞，透過基因技術的改造，阻止神經幹細胞的分化，使細胞在空間上處於未分化狀態，並使細胞體外傳代能力得到提高，永生化神經幹細胞不僅提高了移植治療的安全性及高效性，同時符合倫理道德研究，為神經幹細胞研究提供了更為寬廣的平臺。
1.1 基因治療的工程化神經幹細胞
中樞神經系統疾病發病原因主要由於在中樞神經系統中某種特定的細胞先天性發育不良、後天損傷以及退行性變甚至死亡，這些原因造成神經系統中細胞難以或不能分泌功能性的細胞因子及神經組織結構的破壞。基因治療技術開始於20世紀70年代，經過數十年的發展基因治療技術已經得到長足的進步。研究者們利用基因治療技術，並整合神經幹細胞的生物特性，充分運用於中樞神經系統疾病的治療，攜帶目的基因的神經幹細胞移植進病患體內，起到基因修復、基因置換及基因增強的作用，恢復因為疾病所造成的細胞、組織或器官的生理功能缺陷。目前以神經幹細胞為靶細胞基因治療主要包括，一是以調控神經幹細胞的分化功能為主，匯入神經幹細胞的目的基因在移植體中可控制細胞向所缺失的細胞方向分化。二是以基因修復或置換為主，在基因治療過程當中，在不涉及移植體中其他基因組的改變，矯正基因的異常序列達到治療的效果。最後是以神經幹細胞匯入具有基因增強效果的目的基因，修復以破壞的神經組織，並分泌各種細胞因子，以保護神經系統。神經幹細胞基因治療始於治療帕金森病，是中樞神經系統疾病基因治療的開端和代表，Anton等成功構建了酪氨酸羥化酶為目的基因神經幹細胞，並將其移植進帕金森病模型大鼠的紋狀體中，實驗結果顯示構建的神經幹細胞對帕金森病治療效果明顯並無明顯異常表現。在中樞神經系統自身免疫性疾病方面，Klose等用轉染白介素-10基因的神經幹細胞治療自身免疫性腦脊髓炎，發現神經幹細胞可作為白介素-10的穩定載體，使白介素-10成功表達，同時調節T細胞改善疾病的病程。對於神經幹細胞分化、增殖方面，宋川等採用PCR、分子克隆與測序技術成功構建CDK52pEGFP表達質粒，後將CDK52基因片段成功轉染入體外培養的神經幹細胞中，研究顯示CDK52成功表達後對神經幹細胞具有明顯的促分化後神經細胞的軸突生長、形態成熟，細胞分化明顯、細胞多數為典型的神經元樣或膠質細胞樣。在中樞神經系統損傷、壞死性疾病方面，汪雷等採用NEP1-40作為靶基因，神經幹細胞作為載體細胞，在體外成功建立了能表達NEP1-40的神經幹細胞，將神經幹細胞轉入脊髓損傷大鼠模型並透過行為學判斷對脊髓損傷的影響，結果顯示基因修飾後的幹細胞能夠進一步提高脊髓損傷恢復效果。Kim 等應用逆轉錄病毒作載體將VEGF轉至神經幹細胞並移植到大鼠脊髓損傷部位，發現轉染細胞6周後神經幹細胞增殖明顯，多數分化為成熟的少突膠質細胞，並且VEGF在治療中增加了脊髓損傷部位的.血管密度及增強了神經組織的保護作用。在神經系統腫瘤方面，閆超等利用慢病毒介導的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV7-TK)融合基因轉染神經幹細胞，並將神經幹細胞植入C6膠質瘤動物模型體中，觀察發現植入神經幹細胞的實驗組較對照組腫瘤體積有明顯的縮小，轉染了CK-TK 基因的神經幹細胞對膠質瘤細胞有抑制作用，與其他單一自殺基因相比抗腫瘤效果更佳明顯。Karen等利用神經幹細胞向膠質瘤細胞定向遷移能力且抑制腫瘤生長的特性，構建了具有胞嘧啶脫氨酶(CD)基因片段的神經幹細胞，並與5-氟胞嘧啶聯合移植入動物模型體內，病理結果顯示神經幹細胞核型正常且抑制腫瘤組織生長效果明顯，這種聯合移植對於5-氟胞嘧啶安全性更加穩定。中樞神經系統發育的演變過程極為的複雜，在不同的演變過程當中，不同的基因在其水平範圍內起到的效果也不盡相同。基因工程改造的神經幹細胞作為治療疾病的新型技術，能整合於神經幹細胞上的目的基因主要集中在細胞週期調節因子、腫瘤壞死因子、腫瘤訊號轉導因子等。目前，能夠與目的基因成功的整合成功是神經幹細胞工程化的現階段研究重點。
1.2 可示蹤的工程化神經幹細胞
在神經幹細胞移植治療中樞神經系統疾病中，幹細胞在活體中所起到的效用作用是顯著的，但論其治療過程如神經幹細胞在移植體中存活、遷移、分化等情況還不盡完善，合適的示蹤劑能夠幫助研究者們在無創性條件下識別及監測神經幹細胞治療的過程及機制。神經幹細胞匯入可標誌性的基因片段，能夠很好地觀測移植後神經幹細胞治療過程的生物學變化。常用的標誌基因主要有大腸桿菌乳糖操縱子中的β-半乳糖苷酶(LacZ)、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)。研究表明逆轉錄病毒中可以插入LacZ、GFP等標記分子，透過感染分裂期的細胞，使標誌基因得以表達，這樣就可以對神經幹細胞的增殖、遷移、分化的全部過程進行監測。其中以熒光蛋白標記GFP 應用較多，1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細胞中表達了能發射綠色熒光的GFP，開創了GFP研究與應用先河。近年來，研究發現MRI對示蹤活體神經幹細胞的分辨能力具有較強的表現，但在實際工作中發現某些疾病與正常組織的T1甚至T2弛像時間無明顯差別或差別不明顯，另外，雖然有些病變異常訊號表達較高，但診斷與鑑別診斷仍較困難，這些情況下就需要應用MR增強劑。超順磁性氧化鐵和超小順磁性氧化鐵可在體外標記神經幹細胞，這種示蹤劑具有一種獨特的性質--超順磁性，透過其獨有的性質對神經幹細胞進行標記，並利用MRI顯像技術就可對神經幹細胞移植治療的過程進行全程觀測。國內有研究表明在構建後的帕金森大鼠模型中植入被超順磁性氧化鐵標記的神經幹細胞，移植1周後MRI顯像上可見移植區的變化呈低訊號;10周後，移植區低訊號表現在T2梯度回波仍可被觀察到，證明了利用示蹤劑超順磁性氧化鐵所標記的神經幹細胞，在MRI顯像上能夠清晰地顯示出其分佈和存活情況。除去以上標記神經幹細胞方法外，常用的標記方法還有利用細胞核中插入DNA 雙鏈染料，非分離細胞的標記技術，Y染色體標記等方法。儘管在可示蹤工程化神經幹細胞上取得許多的進展，但在無創性條件下利用影像學技術依舊不能很好的從細胞水平顯示神經幹細胞治療的全部過程。
1.3 永生化神經幹細胞
永生化指的是在細胞發展的過程當中，利用基因工程化技術使細胞週期的連續性得以儲存。透過體外基因調控神經幹細胞得以永生化，其最常用的方法是將編碼後的癌基因蛋白的部分基因片段利用逆轉錄病毒載體轉匯入胚胎神經幹細胞中，細胞終末分化被阻止，在空間上處於未分化狀態，細胞的傳代能力被提高。目前證實不同部位、不同年齡結構的神經幹細胞，透過轉入不同形式的myc、nen、p53、腺病毒EIA以及SV40大T抗原使其具有永生化。細胞的自發性永生化機率非常小，人類細胞的__永生化機率更是罕見。因此，研究者們努力提高永生化的發生率，利用基因轉染等技術手段，主要將各種外源性永生化基因匯入靶細胞當中例如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等達到細胞永生化的目的。端粒是存在於染色體末端，有重複的TTAGGG序列，它具有防止染色體降解、端端融合、重排和染色體丟失等功能，研究者們對多種永生細胞的端粒長度檢測時發現，永生化細胞分裂過程當中其端粒並未出現丟失的現象，這有可能提示細胞增殖能力的無限化可能與端粒長度的維持有某種必然的聯絡，這為神經幹細胞永生化提供了相對的理論機制。神經幹細胞具有良好的多分化潛能，而永生化的神經幹細胞是否能夠依然保持這種良好的特性。研究發現，多數永生化神經幹細胞製備主要是透過利用溫度敏感型突變SV40大T抗原，然而分析表明這種製備的永生化神經幹細胞，癌基因的表達不能夠被充分地下調，如果去嘗試使細胞最終分化將會導致細胞的凋亡。因此，在構建永生化神經幹細胞時，若能充分下調癌基因的表達並使其具有可調控性是十分重要的，同時我們又要考慮到神經幹細胞的分化情況，若能構建不需要營養生長因子而能使細胞分化為目的細胞的系統那就更為的理想。Hoshimarn等使用了四環素控制的基因表達系統，透過逆轉錄病毒載體構建了LINXVmyc，並穩定轉染於體外分離培養的成年鼠海馬神經幹細胞，這種神經幹細胞在體外可以穩定地轉染克隆，v-myc轉錄是可被四環素所調節的，當在細胞培養液中新增四環素後，本身分裂的細胞停止分裂，並且在新增四環素5 d後，NFH 陽性的細胞佔絕大多數，tau陽性細胞半數以上，Vimentin為陰性，這些現象說明癌基因表達可被低濃度四環素所調控，呈現下調趨勢，且細胞分化較為徹底。近年，有研究者成功建立了一種永生化神經幹細胞系，透過轉染技術將外源性人端粒酶催化亞單位基因匯入體外培養的神經幹細胞中，建立了永生化神經幹細胞系，這種神經幹細胞不僅儲存了基本特性，而且在長期的體外培養中可傳至50代仍生長旺盛，分裂速度更加地迅速，可作為種子細胞。永生化神經幹細胞作為合適的體外轉基因治療載體，較普通神經幹細胞具有更多的優勢：(1)永生化神經幹細胞較普通幹細胞具有良好的安全性，研究表明移植治療中，永生化的細胞在移植體中與組織地嵌合十分完整;(2)移植治療當中不需要特殊的免疫反應藥物，不引起免疫反應;(3)永生化細胞作為基因治療的靶細胞時，較普通幹細胞更具有穩定性，基因表達更具備高效性;(4)目前研究表明利用藥物控制的永生化神經幹細胞表達系統，可調節被施加外源性作用因子調節的轉移基因的表達;(5)永生化神經幹細胞可控性較普通神經幹細胞有較大地提高;(6)符合倫理道德。儘管，永生化神經幹細胞的建立，為神經系統疾病治療帶來了新的希望，但我們也應該意識到正常細胞的基因組以及某些遺傳性狀被改變之後才能製備成永生化細胞，對其應用價值有待於進一步評價。
2 神經幹細胞研究的問題與展望
綜上所述，基因修飾等技術構建的工程化神經幹細胞能顯著提高移植治療中樞神經系統疾病的效果。但是，目前利用基因工程技術構建的神經幹細胞，在的移植治療技術中尚屬開端，其仍然面臨各種的難題：(1)中樞神經系統疾病的複雜較為特殊，在治療過程的當中需要多種基因的參與，一種或兩種基因的參與難以完成;(2)針對永生化神經幹細胞，它是由正常細胞的基因組以及某些遺傳性狀被改變之後才被製備而成的，對其生理機制及應用價值有待進一步研究與評估;(3)研究用神經幹細胞大部分經胚胎幹細胞培養而來，其來源尚有理論爭議;(4)工程化神經幹細胞在移植入人體後，其存活、分化、遷移透過何種指標能夠明確顯示，這還需要進一步的研究。總之，工程化神經幹細胞的前途是美好的，它在治療中樞神經系統疾病發面的價值終會得到體現。