生物分離實驗案例
生物分離實驗篇一:生物分離工程實驗講義
實驗一:牛乳中酪蛋白的提取
一、實驗目的
1、掌握等電點法提取蛋白的基本原理及基本操作;2、掌握雙縮脲法測定蛋白含量的基本原理及基本操作。
二、實驗原理
酪蛋白是乳蛋白質中最豐富的一類蛋白質,約佔乳蛋白的80~82%,酪蛋白不是單一的蛋白質,是一類含磷的複合蛋白質混合物,以一磷酸酯鍵與蘇氨酸及絲氨酸的羥基相結合。它還含有胱氨酸和蛋氨酸這兩種含硫氨基酸,但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量約為35g/L,比較穩定,利用這一性質,可以檢測牛乳中是否摻假。
酪蛋白在其等電點時由於靜電荷為零,同種電荷間的排斥作用消失,溶解度很低,利用這一性質,經牛乳調到pH4.6,酪蛋白就從牛乳中分離出來。酪蛋白不溶於乙醇,這個性質被利用來從酪蛋白粗製劑中將脂類雜質除去。
在乳製品加工或成品中,酪蛋白含量是一個常需測定的指標。常用於測定酪蛋白的方法是先將酪蛋白在等電點沉澱,再用凱氏定氮法測定。本實驗採用雙縮脲法測定酪蛋白。其原理為:蛋白質含肽鍵,肽鍵在鹼性溶液中可與銅離子形成紫紅色化合物,在540nm波長處有最大吸收,其顏色深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸組成無關。
三、材料與試劑
市售牛奶
10mg/mL酪蛋白標準溶液(用0.1MNaOH配製)0.1MNaOH溶液、0.2MpH4.6的HAc-NaAc緩衝液
雙縮脲試劑:稱取硫酸銅(CuSO4·5H2O)1.5g,加水100mL,加熱助溶;另稱取酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·4H2O)6.0g、碘化鉀5g溶於500mL水中。兩液混勻後,在攪拌下加入10%NaOH300mL,後用水稀釋至1000mL,貯存於塑膠瓶中。此液可長期儲存,若瓶底出現黑色沉澱則需重新配製。
四、操作步驟
1、牛乳中酪蛋白的等電點沉澱
用量筒量取25mL牛乳兩份分別置於50mL燒杯中,水浴加熱至40℃,在攪拌下慢慢加入到已預熱至40℃的等體積的0.2MpH4.6的HAc-NaAc緩衝液中,混勻,冷卻靜置30min沉澱酪蛋白後,3000r/min離心15min,棄上清液,收集沉澱。一份沉澱用於“除雜”步驟,另一份沉澱用0.1MNaOH溶液溶解並定容至100mL,用於“酪蛋白含量測定”步驟。
2、除雜
將上述沉澱搗碎,加入10mL95%乙醇,攪拌製成懸浮液。將此懸浮液傾於布氏漏斗中,抽濾除去乙醇溶液,再用10mL乙醚-乙醇混合液(1∶1)洗滌沉澱兩次,最後再用10mL乙醚洗滌沉澱兩次,抽乾。
將沉澱從布氏漏斗中移去,在表面皿上攤開揮幹乙醚後,置烘箱中80℃乾燥過夜,稱重(m1)。
3、酪蛋白含量測定
(1)標準曲線的繪製
分別移取酪蛋白標準液0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL於乾燥試管中,不足1.0mL者用0.1MNaOH
溶液補足1.0mL,然後分別加入4.0mL雙縮脲試劑,混勻,室溫下反應30min,測定540nm波長處吸光度。以酪蛋白質量(mg)為橫座標、吸光度為縱座標繪製標準曲線。(2)酪蛋白含量測定
取―步驟1‖中樣品溶液1.0mL,加入4.0mL雙縮脲試劑,混勻,室溫下反應30min,測定540nm波
長處吸光度,查標準曲線,求得酪蛋白質量。平行測定3次,求其平均值,並計算25mL牛乳中酪蛋白的質量(m2)。
五、結果與討論
1、牛乳中酪蛋白含量的計算
含量(g/mL)=
2、酪蛋白提取得率的計算
得率(%)=
m2?100
牛乳體積(25mL)
m1
?100%
m2?100
六、思考題
1、為什麼在等電點沉澱時需加熱至40℃?2、除雜時,能否將三種溶劑的順序顛倒?為什麼?3、雙縮脲法測定蛋白的原理是什麼?
4、比較牛乳中酪蛋白測定含量與理論含量大小,並對測定結果進行討論。
實驗二:大蒜細胞SOD酶的提取與分離
一、實驗目的
1、掌握SOD酶的提取、分離、檢測等一般步驟;
2、掌握酶在提取過程中的兩個重要引數:回收率和純化倍數。
二、實驗原理
超氧化物歧化酶(SOD)是一種就有抗氧化,抗衰老,抗輻射和消炎作用的藥用酶。它可以催化超氧負離子(O-)進行歧化反應,生成氧和過氧化氫:2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和懸浮培養的大蒜細胞中含有較豐富的SOD,透過組合組織或者細胞破碎後,可用PH7.8的磷酸緩衝液體提取。由於SOD不溶於丙酮中,可用丙酮將其沉澱析出。
鄰苯三酚在鹼性條件下可迅速自氧化,釋放出O2-,生成帶色的中間產物,在325nm有最大吸收峰。鄰苯三酚自氧化產生的中間產物在40s-3min這段時間,生成物與時間有較好的線性關係。顏色深→SOD逐漸增多→顏色淺,即酶活力越大,顏色越淺。
三、試劑和材料
新鮮蒜瓣,市售
磷酸緩衝液:0.05mol/L,pH7.8
氯仿一乙醇混合溶劑:氯仿﹕無水乙醇=3﹕5(V/V)丙酮:用前冷卻至4~10℃
0.1mol/LTris—HCl緩衝液(pH=8.2,內含2mmol/LEDTA)10mmol/LHCl
45mmol/L鄰苯三酚(內含10mmol/LHCl)
四、實驗步驟
1、組織或細胞破碎
稱取5g左右大蒜蒜瓣,置於研缽中研磨,使組織或細胞破碎。2、SOD的提取
將上述破碎的組織或細胞,加入2~3倍體積(10-15mL)的0.05mol/L,pH7.8的磷酸緩衝液,繼續研磨攪拌20min,使SOD充分溶解到緩衝液中,然後在5000r/min下,離心15min,收集上清液得提取液。
留出1mL備用,剩餘提取液準確量取體積後進行下步實驗。3、除雜蛋白
提取液加入0.25倍體積的.氯仿一乙醇混合溶劑攪拌15min,5000r/min離心15min,去雜蛋白沉澱,收集上清液得粗酶液。
留出1mL備用,剩餘粗酶液準確量取體積後進行下步實驗。4、SOD的沉澱分離
將上述粗酶液加入等體積的冷丙酮,攪拌15min,5000r/min離心15min,得SOD沉澱。
將SOD沉澱溶於少量(5ml)0.05mol/LpH7.8的磷酸緩衝液中,再加水5mL,5000r/min離心15min,收集上清液,得SOD酶液。準確量取體積。
將上述提取液、粗酶液和酶液分別取樣,測定各自的SOD活力和蛋白濃度。5、SOD活力測定
參照李建武的《生物化學實驗原理和方法》,採用鄰苯三酚自氧化法測定SOD的酶活力。鄰苯三酚在鹼性環境中即可迅速發生自氧化作用,在自氧化過程中產生有色中間物和O2-自由基,反應開始後溶液逐漸變成黃色,在有超氧化物歧化酶存在時,由於它能催化O2-自由基與+H結合生成02和H2O2,從而阻止了中間產物的積累,降低了自氧化速率。中間產物在325nm時有強力的光吸收,採用分光光度計即可檢測。
(1)鄰苯三酚自氧化速率的測定:
在試管中按表1加入各試劑,加入鄰苯三酚後馬上計時,迅速搖勻倒入石英比色皿中,在325nm波長下,從第1分鐘開始,每隔30秒測一次光吸光度,測至第5分鐘。以吸光度為縱座標,反應時間(min)為橫座標繪製反應曲線,計算鄰苯三酚自氧化速率k0(直線斜率)。
表1鄰苯三酚自氧化測定加樣表
試劑
0.1mol/LTris—HCl緩衝液(pH=8.2,內含2mmol/LEDTA)
蒸餾水10mmol/LHCl
45mmol/L鄰苯三酚(內含10mmol/LHCl)
總體積
加樣量(mL)校零管4.54.40.1——9.0
測定管4.54.4——0.19.0
(2)SOD酶活的測定:
在試管中按表2加入各試劑,加入鄰苯三酚後馬上計時,迅速搖勻倒入石英比色皿中,在325nm波長下,從第1分鐘開始,每隔30秒測一次光吸光度,測至第5分鐘。以吸光度為縱座標,反應時間(min)為橫座標繪製反應曲線,計算加入SOD酶樣品後的鄰苯三酚自氧化速率k1(直線斜率)。
表2SOD酶活測定加樣表
試劑
0.1mol/LTris—HCl緩衝液(pH=8.2,內含2mmol/LEDTA)
蒸餾水10mmol/LHCl待測樣
45mmol/L鄰苯三酚(內含10mmol/LHCl)
總體積
加樣量(mL)校零管4.54.30.10.1——9.0
測定管4.54.3——0.10.19.0
(3)酶活力測定
酶活性單位定義為:在lml的反應液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個
活力單位。
按下式計算樣品中SOD酶單位活力:
k0-k1樣品液稀釋倍數
?50%?反應液總體積?
加入樣品液體積單位體積活力(U/ml)=k0
活性單位定義體積
總活力(U)=單位體積活力?樣品液總體積
式中:反應液總體積=9mL;樣品液稀釋倍數=1;加入樣品液體積=0.1mL;活性單位定義體積=1mLl;樣品液總體積=實驗中各樣品實測體積。6、樣品中可溶性蛋白含量的測定
從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液中分別取0.2mL、0.4mL、0.5mL,按提取液50倍、粗酶液20倍、酶液10倍進行稀釋,分別測定稀釋液在260nm和280nm波長處的吸光值,按下式計算可溶性蛋白的含量:
蛋白質濃度(mg/mL)=(1.45A280–0.74A260)×稀釋倍數
總蛋白(mg)=蛋白質濃度×樣品液總體積
五、結果與討論
將試驗結果及相應的計算結果填入下表:
相關計算公式:
力力;回收率=粗酶液(或酶液)總活比活力U/mg=總活力(U);純化倍數=粗酶液(或酶液)比活
提取液總活力提取液比活力總蛋白(mg)
六、思考題
1、在SOD酶提取步驟中應注意的關鍵問題是什麼?2、綜合評價蛋白或酶的提取分離流程優劣的指標有哪些?
生物分離實驗篇二:生物分離工程實驗
實驗一:茶多酚標準曲線的測定
儀器:紫外分光光度計,比色皿,天平,容量瓶,移液管,pH計、試管
藥品:沒食子酸丙酯或茶多酚,酒石酸鉀鈉,硫(轉載於:g沒食子酸丙酯,蒸餾水溶液,移入25mL容量瓶並稀釋至刻度,搖勻,配製成1mg/mL的標準溶液
A酒石酸亞鐵溶液配製
準確稱取0.1g硫酸亞鐵,和0.5g酒石酸鉀鈉,混合,蒸餾水溶解後移入100mL容量瓶,稀釋至刻度,搖勻。
pH7.5磷酸鹽緩衝液配製
磷酸氫二鈉:準確稱取分析純磷酸氫二鈉2.969g,蒸餾水稀釋溶解,移入250mL容量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻,為a液
磷酸二氫鉀:準確稱取分析純磷酸二氫鉀,、2.2695g,蒸餾水溶解,移入250mL容量瓶,定容,B。
取A液體85mL,B液體15mL混合均勻,即成。
B標準曲線繪製
分別吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25mL的沒食子酸丙酯標準液於25mL容量瓶中,加入蒸餾水4mL,再加入酒石酸亞鐵溶液5mL,用pH7.5的磷酸鹽緩衝溶液稀釋至刻度,搖勻,分光光度計在540nm處,1cm比色皿,分別測定吸光度。空白參比操作同上,不加沒食子酸丙酯。以容量瓶中沒食子酸丙酯的絕對含量mg為橫座標,吸光度為縱座標,繪製標準曲線,做線性迴歸。
C樣品測定
取適量樣品加入容量瓶,操作同上,沒食子酸丙酯含量乘以換算係數1.5,求得茶多酚。
實驗二超聲法和迴流法提取茶多酚的比較
實驗儀器:
超聲提取器、布氏漏斗、抽濾瓶、真空泵、燒瓶、量筒、分光光度計、比色皿、容量瓶等、實驗試劑
茶葉、純淨水、茶多酚(沒食子酸丙酯)、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等
操作方法
1、材料準備
稱取一定量的茶葉,研缽粉碎。備用
2、提取
A、超聲提取法
稱取5g粉碎後茶葉末,放入燒瓶(塑膠袋密封),加入100mL水,於超聲提取器,50℃提取20min,抽濾,定容至100mL,待測。
B、迴流提取法
稱取10g粉碎後茶葉末,放入圓底燒瓶,加入100mL水,80℃提取40min,分別在1、3、5、7、10、15、20、30、40min取3mL樣品,小漏斗過濾後,待測。測得茶多酚含量(mg/mL)以茶多酚含量為縱座標,時間為橫座標繪製曲線。
3.含量測定
按照標準曲線的方法測定含量。
所需試劑及儀器
試劑:
沒食子酸丙酯或者茶多酚,酒石酸鉀鈉,硫酸亞鐵,磷酸氫二鈉,磷酸二氫鉀,
儀器:
紫外分光光度計,水浴鍋,電子天平,pH計,超聲提取器,量筒(100mL*1),容量瓶(25mL*8,100mL*4,250mL*2),比色皿*5,移液管(1.0mL*2,0.5mL*2,2mL*2,5mL*4)三角瓶250mL*2,小漏斗*2,試管架